免疫組化Immunohistochemistry
一、概述
1、定義
用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。
2、原理
根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。
3、分類
1）按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。
2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3）按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內源性生物素含量高的組織抗原檢測。
4、實驗所用標本
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。
5、實驗所用抗體
免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。
二、免疫染色
下面以石蠟切片的免疫組化為例演示詳細操作流程（SP法）:
1.60℃烤片2小時
2.脫蠟。二甲苯脫蠟15分鐘，三次
3.水化。依次經過無水乙醇、95%、90%、80%、70%，各5分鐘，蒸餾水（或自來水）5分鐘
4.PBS（洗液C-0079）洗5分鐘，三次
5.抗原修復。枸櫞酸緩沖液（修復液，C-0070）（約92-95℃）煮沸（沸水浴）修復15分鐘，自然涼至室溫。PBS洗5分鐘，三次
6.3%雙氧水（包含在SP-0023中）消化內源性的過氧化物酶，20分鐘，PBS洗5分鐘，三次
7.正常山羊血清（包含在SP-0023中）封閉，37℃20分鐘
8.一抗孵育，4℃過夜. （抗體稀釋液C-0007）
9.PBS洗5分鐘，三次
10.二抗孵育，37℃20分鐘（二抗為生物素標記的羊抗兔IgG，包含在SP-0023中），PBS洗5分鐘，三次
11.三抗孵育，37℃20分鐘（三抗為辣根酶標記的鏈霉親和素，包含在SP-0023中），PBS洗5分鐘，三次
12.DAB（顯色劑C-0010）顯色，鏡下觀察結果，適時終止
13.蘇木素（C-0021）復染5分鐘，自來水沖洗片刻，1%的鹽酸酒精（75%）溶液（此試劑無法銷售，請自行配置，配制比例為：100ml 75%酒精+1ml濃鹽酸）分化30秒，自來水沖洗5分鐘藍化
14.脫水。依次經過70%、80%、90%、95%、無水乙醇，各5分鐘，二甲苯15分鐘，三次
15.封片，中性樹膠（C-0073）封片
三、有關免疫組化實驗的重要問題
（一）組織材料處理
1.取材要取新鮮組織，大小合適，用生理鹽水洗凈
2.固定固定就是把病理標本組織浸泡在固定液中（常用的有4%多聚甲醛），使組織或細胞內蛋白質凝聚、沉淀或變性成為不溶性物質，并保持細胞原有的形態結構
3.洗滌固定后一定要把滲透到組織里面的固定液洗去，以利于進行脫水，若組織中留有較多的固定液，則將影響脫水劑，甚至可在組織中發生沉淀而影響后續染色及觀察，對于陳舊性標本或固定時間過長的標本，更應注意流水沖洗。
4.脫水脫水必須徹底，若脫水不盡，則切片后組織與空氣接觸即干燥收縮，蠟塊切面出現凹陷現象，雖可勉強切片，但染色效果差，染色時也容易脫落
5.透明乙醇等脫水劑不能溶解石蠟，所以浸蠟之前需要一個既能與乙醇混合又能溶解石蠟的媒劑，以便使石蠟浸入到組織中去，當組織中全部被透明劑占有時，光線可以透過，組織可呈現不同程度的透明狀態，此現象稱為透明。如果組織不能透明，表明脫水未盡必須重新返工，否則影響到浸蠟的進行，但返工時往往效果不好
6.浸蠟浸蠟時間根據組織的類型可適當調整，一般原則較小組織脫水時間和浸蠟時間較短；骨、肌肉等堅硬組織脫水和浸蠟時間不宜過長；脂肪組織、疏松結締組織脫水和浸蠟時間需增加
7.包埋包埋時應注意組織的包埋方向，否則將影響組織切片的形態。包埋用的石蠟要和浸蠟用的石蠟熔點一致，包埋用的石蠟溫度要稍高于浸蠟的溫度。包埋好后可置于冷水中使石蠟迅速冷凝。包埋好的石蠟塊應呈均勻的半透明狀，如出現白色渾濁則其中存在石蠟的結晶，這種蠟塊不能切除薄的切片。可能是組織脫水不充分，組織內或石蠟中混有透明劑，或包埋時動作太慢或石蠟凝固太慢所致，所以冷卻時水溫不能過高，否則就不宜迅速凝固
8.切片可以將制作好的蠟塊置于低溫環境預冷，切出的切片連續性較好，有利于展片，一般切片厚度4-6um
（二）抗原修復
組織在制作過程中，由于固定液的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發生扭曲，致使在免疫組化的染色過程中不能將其顯示出來，為了解決上述的問題，利用化學試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來或修正過來的過程稱為抗原修復。
北京博奧森常用的抗原修復液有：0.01M枸櫞酸（pH6.0）、0.05M EDTA（pH8.0）、0.01M TBS（pH7.4）、胃蛋白酶、胰蛋白酶
北京博奧森常用的抗原修復方法：
方法1：沸水浴修復，將盛有修復液和玻片的燒杯置于沸水浴環境，保持外部沸騰狀態15min，自然冷卻至室溫。
方法2：微波修復，將盛有修復液和玻片的燒杯置于微波爐中，高火5min，停火3min，中火5min，自然冷卻至室溫。
方法3：高壓修復，修復液加入高壓鍋加熱至沸騰，放入玻片，封蓋加壓持續加熱至噴氣時開始計時修復2min，自然冷卻至室溫。
方法4：使用胃蛋白酶修復，將胃蛋白酶修復液加入到組織上，37℃，消化30min
抗原修復，必須注意以下問題：
1、修復液的選擇。
0.01M枸櫞酸（pH6.0）：應用最多的抗原修復液，適用于大多數的抗原，用該液修復后的抗原表達增強，抗原的定性和定位很理想，結果不錯;
0.05M EDTA（pH8.0）：應用較多的抗原修復液，修復能力較強，對于保存時間較長的切片或目的蛋白表達較弱的組織有很好的修復效果，需要控制好修復時間，否則容易出現較重的背景;
0.01M TBS（pH7.4）：中性修復液，適用于大多數抗原，對于核定位蛋白有較好的修復效果;
胃蛋白酶：應用較多的抗原修復液，適用于大多數的抗原，使用溫度37℃，對于容易脫片的切片有很好的保護作用。
胰蛋白酶：應用較多的抗原修復液，適用于大多數的抗原
2.抗原熱修復時應選擇最佳溫度。
據實驗認為溫度在92℃－98℃是合適的，尤其在95℃為最好，這是因為：（1）這種溫度未達沸騰，切片不容易脫離載玻片；（2）能夠解離和破壞與蛋白交聯的甲醛醛鍵等，處理時可以隨意選擇和確定抗原修復的作用時間。如果選擇高壓修復，因為溫度較高，時間不宜過長
3.抗原修復時有效溫度所需持續時間根據各單位的設備條件以及使用的儀器不同，抗原修復時在有效的溫度范圍內所持續的時間也不一樣。
4.抗原修復液必須遵循自然降溫規律，否則效果不好或達不到抗原修復的目的。
5.盡量使用足量的抗原修復液，防止切片干涸。
6.切片必須附貼牢固，否則發生掉片。
（三）合適的抗體稀釋度
抗體的濃度是免疫染色的關鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子過多于抗原決定簇，可導致抗體結合減少，產生陰性結果。此陰性結果并不一定是缺少抗原，而是由于抗體過量，這種現象類似于凝集反應中的前帶效應（prozone effect）。因此，必須使用一系列稀釋做“棋盤式效價滴定”，檢測抗體的合適稀釋度，以得到最大強度的特異性染色和最弱的背景染色。抗體稀釋度應根據：1.抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；2.一般講，應用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長；3.對于抗體與非特異性蛋白的結合，只有高稀釋度時才能防止其非特異性背景染色；4.稀釋用緩沖液的種類，標本的固定和處理過程等也可影響稀釋度，所以合適的稀釋度應根據具體情況測定。抗體的稀釋主要是指第一抗體，因為第一抗體中特異性抗體合適的濃度是關鍵，應用高稀釋度第一抗體僅高親和力的特異性染色反應，減少或消除其中交叉抗體反應。
（四）血清封閉，減少非特異性結合
組織中非抗原抗體反應出現的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加與制備第二抗體相同動物的非免疫血清（1:5-1:20），封閉組織上帶電荷基團而除去與一抗非特異性結合。必要時加入2%-5%牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色，作用時間為10-20min。免疫熒光染色時，可用0.01%伊文藍（PBS溶液）稀釋熒光抗體，對消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。洗滌用的緩沖液中加入0.85%-1%NaCl成為高鹽溶液，充分洗滌切片，能有效的減少非特異性結合而減少背景染色。
（五）設置對照
其目的在于證明和肯定陽性結果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照，常用的對照方法包括：1. 陽性對照；2. 陰性對照；3. 阻斷實驗； 4.替代對照；5. 空白對照；6. 自身對照；7. 吸收實驗.
1. 陽性對照用已知抗原陽性的切片作對照與待檢標本同時進行免疫組織化學染色，對照切片應呈陽性結果，成為陽性對照。證明全過程均符合要求，尤其當待檢標本呈現陰性結果時，陽性對照尤為重要。
2.陰性對照用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，成為陰性對照，是陰性對照的一種。其實空白、替代、吸收和抑制都屬于陰性對照。當待檢標本呈陽性結果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。
（五）顯色觀察
免疫酶染色應注意控制：
1. 呈色質濃度和反應時間。增加成色質的量和（或）增加底物反應時間，可增加反應產物強度；著色太深可減少反應時間。
2. 過氧化物酶顯色時，H2O2濃度較大將使顯色反應過快而至背景加深；過量H2O2可能抑制酶的活性。
（六）免疫組化結果的判斷
對免疫組化結果的判斷應持科學的慎重態度，要準確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結果，必須嚴格對照實驗，對新發現的陽性結果，除有對照實驗結果之外，應進行多次重復實驗，可用幾種方法進行驗證。必須學會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學者更為重要，否則會得出不科學的結論。特異性染色和非特異性染色的鑒別點主要在于特異性反應產物常分布于特定的部位。如胞漿內，也有分布在細胞核和細胞表面的，即具有結構性。特異性染色表現為在同一切片上呈現不同程度的陽性染色結果。非特異性染色表現為無一定的分布規律，常呈某一部位成片的均勻著色，細胞和周圍的結締組織均無區別的著色，或結締組織呈現很強的染色。非特異性染色常出現在干燥切片的邊緣，有刀痕或者折疊的部位。在過大的組織塊，中心固定不良也會導致非特異性染色。有時可見非特異性染色和特異性染色同時存在，由于過強的非特異性染色背景不但影響對特異性染色結果的觀察和記錄，而且令人對其特異性結果產生懷疑。
免疫組化的呈色深淺可反映抗原存在的數量，可作為定性、定位和定量的依據。
1.陽性細胞染色分布有三種類型：細胞漿、細胞核、細胞膜表面。大部分抗原見于細胞漿，可見于整個胞漿或部分胞漿
2.陽性細胞分布可分為灶型和彌漫性
3.由于細胞內含抗原量不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應為非特異性
4.陽性細胞染色定位于單個細胞，且與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。
5.切片邊緣、刀痕或褶皺區域，壞死或擠壓的細胞區，膠原結締組織等，常表現為相同的陽性染色強度，不能用于判斷陽性。
（七）染色失敗的幾種原因
1.所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內，全部呈陰性反應，原因可能是：（1）染色未按嚴格操作步驟進行；（2）漏加一種抗體，或抗體失效；（3）緩沖液內含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；（4）底物中所加H2O2量少或失效；復染或脫水劑使用不當。
2.所有切片均呈弱陽性反應：（1）切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了；（2）緩沖液配制中未加氯化鈉或pH不準確，洗滌不徹底；（3）使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長；（4）抗體溫育的時間過長；（5）H2O2濃度過高，呈色速度過快；（6）粘附劑太厚。
3.所有切片背景過深：（1）未用酶消化處理切片；（2）切片或涂片過厚；（3）漂洗不夠；（4）底物呈色反應過久；（5）蛋白質封閉不夠或所用血清溶血；（6）使用全血清抗體稀釋不夠。
4.陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應，固定和處理不當是最常見的原因。對于陽性結果的定量判斷，常規方法是根據呈色深淺和陽性細胞數量分類計數，以（-）、+、++、+++等分級和計數統計。
